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咱们先容一种用于及时检测与轻浮食物及环境样品中培养情景下病原体的新式范例。该范例将名义增强拉曼散射（SERS）纳米颗粒与一种新式均相免疫分析时代相结合，可在无需洗涤标准或复杂样品前处理的要求下，对胃消化食物等复杂样品中的病原体达成高机灵检测。SERS符号的免疫分析试剂置于培养增菌容器内，在培养过程中可透过容器壁及时监测信号。这种在悉数这个词增菌过程中对病原体载量的贯穿监测，达成了食物病原体的快速、免东说念主工骚扰检测。此外，将食物病原体免疫分析径直整合至增菌容器中，可达周密紧闭生物安全检测，从而权贵编造增菌后病原体浑浊掌握环境的风险。本文展示了诓骗该SERS系统在多种基质中（生牛肉糜、生禽肉糜、巧克力奶、金枪鱼沙拉、菠菜、布里干酪、热狗、熟食火鸡肉、橙汁、可乐，以及不锈钢名义采样拭子与海绵）对大肠杆菌、梵衲氏菌或李斯特菌的检测拆伙，并与平板计数法对比，考据了该范例的准确性。

一、媒介

食源性疾病对社会影响首要，不仅体面前健康层面，还带来高额医疗本钱。据好意思国疾病约束与看守中心（CDC， 2012）猜度，好意思国每年约有1/6的东说念主口（即4800万东说念主）患病，12.8万东说念主入院，3000东说念主死于食源性疾病。另有估算炫耀，好意思国每年因食源性疾病产生的医疗关联开销高达1520亿好意思元，其中尤以梵衲氏菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌及迂回杆菌等引发的细菌感染最为凸起。好意思国现时的食物安全水平，是政府监管与受阛阓激励（如法律背负、品牌价值、声誉及销量）驱动的行业自主监测共同作用的拆伙。从菠菜、哈密瓜到辣椒等食物引发的多起广受存眷的食源性疾病暴发事件，加重了公众担忧，并最终促成《2011年食物安全当代化法案》的颁布。

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食物病原体检测对象可涵盖从甘愿象制品的食物样品，以及从台面、大地、排水口和加工建造汇聚的环境样品，这亦然企业危害分析与重要约束点（HACCP）体系的遑急组成部分（好意思国食物药品监督管制局， 1997）。关于单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌O157:H7等重要东说念主类致病菌，许各种品实践“零容忍”要求。食物样品中即使仅存在单个、可能已严重受损的活病原体也必须检出，这一要求鼓舞了现存主流病原体检测时代的筛选与发展。面前，悉数食物病原体检测均必须经过培养增菌标准，以富集样品中可能含量极低的病原体，并确保达到分析范例的检测限。该检测过程自然会延长出拆伙时辰，因为无法事前深入落拓样品的运行病原体载量。因此，增菌决策时长必须按“最坏情况”确立（即需复苏1个受损病原体）。这就导致病原体载量较高的样品被过度培养，进而形成检测拆伙蔓延。培养标准完成后，需取部分样品接受传统平板培养时代检测，或更常用的快速检测范例，包括免疫分析法与基于PCR的检测时代。

自然在病原体分析检测前对食物和环境样品进行培养约略保证所需的检测机灵度，但这类范例存在诸多公认的弊端。滥觞亦然最主要的极少，便是出拆伙时辰较长。面前已有多个团队正在研发镌汰检测时辰的范例，这些范例主要聚焦于翻新分析检测技能，举例进一步编造检测限，或是检测品貌更高的病原体生物标记物如信使 RNA（mRNA）。研究东说念主员也在尝试征战更优的培养基，使主义病原体约略优先于布景微生物菌群助长。此外，还有栽植主义拿获服从的关联研究。Pathatrix® Auto 自动化仪器接受专利时代，通过将沿途样品在固定有顺磁性颗粒的 “拿获相” 上轮回流动，达成对病原体的浓缩。主义微生物被拿获在固定磁珠上，经过洗涤、洗脱后用于后续检测。

生物功能化磁性纳米颗粒（MNP）越来越多地被用于病原体的浓缩与分离，而生物功能化检测颗粒则被用于主义物检测。研究东说念主员报说念了一种范例：将抗体偶联的磁性纳米颗粒用于拿获添加到苹果汁中的大肠杆菌 O157 菌体，随后经过屡次洗涤完成主义病原体的拿获与分离。再将名义增强拉曼散射（SERS）纳米颗粒加入分离赢得的磁性纳米结合体中，接着进行新一轮磁分离和三次以上洗涤。最终将磁性结合体悬浮于磷酸盐缓冲液（PBS）中进行 SERS 检测。研究东说念主员报说念了类似范例，接受磁性微球进行分离，并以抗体偶联量子点看成荧光符号物，可同期检测三种食源性细菌。在这两种范例中，病原体 - 纳米颗粒结合体均需从食物基质均分离出来，再通过很是光学检测完成测定。

现存检测过程的一个重要弊端在于，增菌培养收尾后必须掀开样品容器，由操作主说念主员进行样品前处理并开展分析检测。若是运行样品中存在病原体，培养标准可使病原体浓度最高达到 10∧（8）–10∧（9）CFU/mL，因此培养后掀开样品容器会使操作主说念主员和环境靠近浑浊风险。这种透露风险可能会导致好多食物坐褥商不肯在现场开展病原体检测，转而选拔将样品送往外部实验室检测，从而产生独特本钱并形成时辰延误。

咱们报说念了一种基于纳米时代的新式免疫分析范例，该范例诓骗名义增强拉曼散射纳米颗粒，将病原体检测径直集成在增菌培养容器内，无需洗涤标准，可径直在食物样品中完成检测。这种基于颗粒的免疫分析接受磁珠反复拿获培养容器中助长的病原体。名义增强拉曼散射纳米颗粒用于产生信号，可径直透过培养容器侧壁读取，无需任何洗涤或分离标准。自然基于名义增强拉曼散射的均相免疫分析已有关联报说念，但这种检测体式在细菌培养体系中的内在适用性尚未赢得研究。本文拆伙标明，该范例可在培养增菌过程中对食物样品中的病原体达成及时、高机灵、特异性检测。

二、材料与范例

2.1. 名义增强拉曼散射均相检测

名义增强拉曼散射气候已有诸多文件进行过详备发扬。浅薄来说，位于贵金属纳米结构名义（如金纳米颗粒）近邻的拉曼活性分子，会对入射光产生增强拉曼散射。拉曼散射是一种非弹性散射过程，散射光子的频率与入射光不同，入射光子与散射光子之间的能量差对应分子的振动模式。在本研究中，拉曼信号由SERS 标签提供：该标签以金纳米颗粒为中枢，名义包覆拉曼活性陈诉分子（“拉曼染料”），再用玻璃进行包裹（图 1a.）。玻璃包覆层约略踏实拉曼陈诉分子，提神其从金纳米颗粒名义零星，确保拉曼信号在复杂生物流体中依然踏实。玻璃层还可拦阻卵白质、膜碎屑及食物样品中的其他身分吸附在金名义，幸免这些身分产生干扰性拉曼信号。因此，测得的拉曼信号与已知拉曼染料的光谱透彻对应，不同拉曼染料可产生私有的光谱特征（图 1b.）。这种 “光谱条形码” 可恣意与样品中的布景荧光等其他光学信号区别开。此外，当 SERS 标签在 785 nm 波长下被激励时，拉曼光谱辐照在近红外波段，此时血液、食物等复杂样品的光给与最小。而且，由于每种拉曼陈诉分子均提供私有的光谱特征，SERS 时代相配适用于多组分同步检测。

图1.（彩色图）名义增强拉曼散射免疫检测。 a）名义增强拉曼散射纳米标签结构默示图。 b）403号与420号名义增强拉曼散射标签的拉曼光谱，展示了可达成高通量多组分检测的私有光谱指纹。 c）名义增强拉曼散射检测旨趣默示图，主义病原体被“夹心”结合在名义增强拉曼散射标签与偶联了特异性抗体的超顺磁性微颗粒之间。

咱们将名义增强拉曼散射标签应用于磁拿获夹心免疫分析，如图 1c. 所示。该免疫分析无需洗涤标准，可径直在食物样品中进行。在检测体系中，抗体等亲和试剂分别偶联在名义增强拉曼散射标签与超顺磁性微颗粒（以下简称磁性颗粒）上。偶联于名义增强拉曼散射标签和磁性颗粒的亲和试剂不错交流或不同，只消约略使主义物（如细菌病原体）同期结合（夹心）在名义增强拉曼散射标签与磁性颗粒上即可。将抗体修饰的名义增强拉曼散射标签与抗体修饰的磁性颗粒加入含有细菌病原体的食物样品后，病原体会被夹心结合在名义增强拉曼散射标签与磁性颗粒之间，其特异性由所选择的抗体决定（如梵衲氏菌特异性抗体）。随后将磁铁贴在样品容器外侧，使磁场鸿沟内的磁性颗粒富集在容器侧壁。由于名义增强拉曼散射标签不具有磁性，独一通过名义增强拉曼散射标签 - 病原体 - 磁性颗粒三明治结构结合在磁性颗粒上时，才会被一同富集到磁千里淀区。因此，磁千里淀区的拉曼信号强度可径直反应样品中病原体的含量。千里淀区的拉曼光谱可透过样品容器侧壁径直读取，无需夹心免疫分析中频繁需要的独特洗涤或孵育标准。

尽管此前已有基于名义增强拉曼散射的检测范例被报说念，但该时代以往均用于增菌培养收尾后从细菌培养液中取出的样品。在图 1c. 所示范例中，免疫检测在增菌全程于培养容器内反复进行。咱们发现，磁富集千里淀的反复形成与分散不会防止细菌助长，且本研究所选择的抗体在最高 42℃要求下至少 48 小时内仍保捏活性。因此，名义增强拉曼散射免疫检测试剂可用于及时测定病原体浓度。遑急的是，由于接受的是带有特异性亲和试剂的夹心免疫分析法，咱们约略及时检测特定病原体，而非总生物负荷。将食物样品加入含有名义增强拉曼散射试剂与磁颗粒试剂的容器中，两种试剂均偶联了针对主义病原体的特异性抗体，再加入液体培养基，随后对悉数这个词容器进行孵育以促进病原体增殖。在孵育时代的不同时代点施加磁场，使磁颗粒及结合的名义增强拉曼散射标签富集到容器壁上。随后用激光映照富集的磁颗粒千里淀区，并在配备电荷耦合器件检测器的光谱仪上对关联名义增强拉曼散射信号进行检测与定量。汇聚拉曼光谱后，飘荡容器使悉数颗粒从头分散至悬液中，不息与样品相互作用。培养初期，病原体浓度可能过低而无法检出，但跟着样品捏续孵育，病原体载量会握住升高，最终产生可检测的名义增强拉曼散射信号。通过每隔 10–30 分钟类似进行磁富集、检测与分散操作，可对名义增强拉曼散射信号进行贯穿监测，达成病原体的及时检测与定量。

2.2. 拉曼活性（名义增强拉曼散射）纳米颗粒的制备

名义增强拉曼散射标签由 60 nm 金颗粒中枢组成，中枢名义包覆特定的拉曼陈诉分子，再由 30–35 nm 厚的保护性玻璃层包裹。胶体金通过在柠檬酸钠与盐酸羟胺搀和体系中，用硼氢化钠还原四氯金酸水溶液制备。随后用 3 - 氨丙基三甲氧基硅烷对金颗粒进行修饰，每 1000 cm∧（2） 胶体名义积加入 200 nmol 拉曼陈诉分子。所用拉曼陈诉分子为 5-(4 - 吡啶基)-1，3，4 - 噁二唑 - 2 - 硫醇（标签 403）和 4，4'- 联吡啶（标签 420），选拔依据是信号强度及可产生易于区别的光谱特征。加入拉曼陈诉分子后，接受斯托伯法将二氧化硅层助长至所需厚度。

2.3. 磁性颗粒

磁珠购自赛默飞世尔科技，包括已预偶联抗体的家具与功能化基珠，后者按下述范例后续偶联抗体。

2.4. 抗体及偶联范例

抗大肠杆菌 O157:H7 抗体购自 Meridian Life Science®，对 O157:H7 具有特异性。抗梵衲氏菌属抗体购自 Virostat或 SDIX。后者与 Romer Labs® Technologies 公司 RapidChek® 侧向流检测试剂盒中所用抗体交流，该试剂盒为通过 AOAC 认证的检测试剂盒。不异，抗李斯特菌属抗体来自通过 AOAC 认证的 Romer Labs® Technologies 公司 RapidChek® 李斯特菌属侧向流检测试剂盒。接受 NHS - 马来酰亚胺交联剂将抗体偶联至巯基化的名义增强拉曼散射标签。接受旧例的 EDC/NHS 化学反应将抗体偶联至羧基化磁性颗粒，抗大肠杆菌 O157 试剂之外，该试剂径直购自赛默飞世尔科技，为预偶联家具。尽管赛默飞世尔科技的该试剂可识别 O157 血清群，但由于名义增强拉曼散射纳米颗粒上偶联的大肠杆菌抗体具有特异性，所测得的名义增强拉曼散射信号对 O157:H7 具有特异性。在用于细菌培养实验前，先拒抗体偶联的名义增强拉曼散射标签与磁性颗粒进行考据：将二者在缓冲液中搀和，加入已知浓度的细菌，测定磁千里淀区的名义增强拉曼散射信号。通过细菌梯度稀释弧线测得的分析检测限约为 10∧(5) CFU/mL。

2.5. 大肠杆菌 O157:H7 东说念主工浑浊的食物与海绵样品

大肠杆菌 O157:H7在养分肉汤或缓冲卵白胨水中培养，随后稀释至各实验所需的相应培养基中，具体如下。海绵样品用缓冲卵白胨水中的 700 CFU 大肠杆菌 O157:H7 进行接种。生牛肉糜与生鸡胸肉样品分别接种 10∧（3） CFU/g（牛肉）和 10∧（6）CFU/g（鸡肉）的大肠杆菌 O157:H7，并在矫正胰卵白酶大豆肉汤 + 更生霉素培养基中增菌。橙汁与好意思味可乐样品在通用前增菌肉汤中稀释，并接种 100 CFU/mL 大肠杆菌 O157:H7。菠菜样品经巴特利磷酸盐缓冲液漂洗，用 2 倍浓度缓冲卵白胨水稀释，并接种 38 CFU/mL 大肠杆菌 O157:H7。悉数样品按 1:10（质地 / 体积）比例稀释于培养基中，径直放入原型仪器（下文胪陈），在 35 ℃要求下进行监测与检测。

2.6. 李斯特菌东说念主工浑浊的不锈钢名义

取 10 片不锈钢试片（1 英寸 ×1 英寸），每片接种 376 CFU 单核细胞增生李斯特菌，并同期接种 50 倍浓度的杂菌 —— 表皮葡萄球菌（环境分离株，BD 菌种保藏库）。对照组试片仅接种表皮葡萄球菌。悉数试片均接受磷酸盐缓冲液 + 10% 脱脂乳配制的菌悬液进行接种。接种后的试片自然干燥过夜，使菌体处于受损情景。次日，用 D/E（Dey/Engley）肉汤润湿环境采样拭子，在每片试片名义擦抹采样，随后将拭子放入含有 RapidChek® 李斯特菌 40 小时一步法培养基及偶联 SDIX 抗李斯特菌抗体的名义增强拉曼散射试剂的培养管中。随后将培养管径直放入仪器，在 30 ℃要求下进行监测与检测。

2.7. 梵衲氏菌东说念主工浑浊的生牛肉糜

鼠伤寒梵衲氏菌和肯塔基梵衲氏菌（BD 菌种保藏库）过夜培养物在添加补充剂的 RapidChek® SELECT™梵衲氏菌低级培养基中培养。将梵衲氏菌培养物用交流培养基进一步稀释，以约 1 CFU/25 g 的水平接种到生牛肉糜中。接种后的牛肉糜在 4 ℃下进行约 48 小时低温要挟处理。取 25 g 接种样品加入 225 mL 含补充剂的RapidChek® SELECT™梵衲氏菌低级培养基中，均质后于 42 ℃增菌过夜（约 18 小时）。次日早晨，取部分增菌液用于名义增强拉曼散射免疫检测、平板计数和侧向层析实验。在名义增强拉曼散射实验中，将 50 μL 增菌液加入装有检测试剂的 5 mL RapidChek® SELECT™梵衲氏菌次级培养基培养管中。加盖后放入仪器，在 42 ℃下不息孵育与检测。侧向层析实验按照 Romer Labs® 公司 RapidChek® 侧向层析范例完成；平板对照则取 100 μL 增菌液在显色平板上涂布计数。此外，在增菌前取部分接种牛肉样品送至第三方寂然实验室，接受最大可能数法（MPN）测定菌量，并通过有氧平板计数（APC）测定布景杂菌量。

2.8. 自然浑浊的生禽肉样品

禽肉样品制备方法与生牛肉糜交流，区别在于生鸡肉糜与火鸡肉糜未进行东说念主工接种。每份样品取部分送至第三方寂然实验室检测 MPN、APC，以及若检出梵衲氏菌则轻浮其血清型。

2.9. 李斯特菌东说念主工浑浊的食物

单核细胞增生李斯特菌、单核细胞增生李斯特菌、西尔李斯特菌和韦氏李斯特菌的过夜培养物在 RapidChek® 李斯特菌 40 小时一步法培养基中培养。将各菌株用交流培养基稀释后，以 0.3–200 CFU/g 的多个梯度分别接种到布里干酪、熟食火鸡肉、热狗、菠菜或金枪鱼沙拉中。食物样品按 1:10（质地 / 体积）加入上述李斯特菌培养基，在 30 ℃培养箱中增菌。培养 22 小时后，取 5 mL 各类品转入含名义增强拉曼散射检测试剂的培养管中，再放入仪器在 30 ℃下不息孵育与检测。名义增强拉曼散射拆伙通过取 100 μL 样品在显色平板上涂布计数进行考据。

2.10. 检测时辰与病原体载量干系研究

鼠伤寒梵衲氏菌过夜培养物在添加补充剂的 RapidChek® SELECT™梵衲氏菌低级培养基中培养。将梵衲氏菌培养物用交流培养基进行 10 倍梯度稀释，以 10∧(-1)–10∧(6)CFU/g 或 CFU / 平方英寸的接种量分别接种到巧克力奶、花生酱或 1 英寸 ×1 英寸不锈钢名义。不锈钢样品自然干燥过夜，使菌体处于受损情景。次日，用 D/E 肉汤润湿环境采样拭子，在每片试片名义擦抹采样，豪门国际娱乐随后将拭子放入含有 5 mL 添加补充剂的 RapidChek® SELECT™梵衲氏菌低级培养基以及偶联抗梵衲氏菌多克隆抗体的名义增强拉曼散射试剂和磁性颗粒的培养管中。接种的巧克力奶和花生酱样品按 1:10（质地 / 体积）在添加补充剂的 RapidChek® SELECT™梵衲氏菌低级培养基中稀释，取 5 mL 分装至含有名义增强拉曼散射检测试剂的培养管中。将培养管径直放入仪器，在 42 ℃要求下进行监测与检测。

2.11. 名义增强拉曼散射检测装配与培养管

名义增强拉曼散射光谱由波长踏实的激光器产生，激光器在 785 nm 波长下输出功率 50 mW，该波长下生物材料的光给与最小。激光器与相应滤光片、聚焦和汇聚透镜集成于定制读取探头（Innovative Photonic Solutions， Monmouth Junction， NJ）中，用于激光传输与拉曼散射光汇聚。读取探头将光耦合参加 200 μm 芯径多模光纤，光纤将拉曼散射光传输至为拉曼光谱优化的光纤耦合微型光谱仪。这些组件组成名义增强拉曼散射检测系统的中枢。如图 2. 所示，名义增强拉曼散射检测系统集成于定制培养箱中，可在孵育过程中对样品进行贯穿飘荡。在预设时辰点（孵育时代每 10–30 分钟），将磁铁置于培养管侧壁形成磁千里淀。读取每个千里淀的名义增强拉曼散射光谱，并将汇聚光谱与参考光谱库比对，策划名义增强拉曼散射标签权重悉数。该标签权重是汇聚光谱中名义增强拉曼散射标签组分与已知参考光谱之间的比例悉数，反应来自拉曼陈诉分子的检测信号强度。名义增强拉曼散射检测系统对标签权重随时辰变化进行监测，生成助长弧线。标签权重高于基线水平即判定为病原体检测阳性。每次名义增强拉曼散射读数后，将磁铁从培养管侧壁移除，复原样品孵育，飘荡使磁千里淀从头分散。培养管接受模范规格，直径 16 mm、长度 100 mm，带螺旋盖。使用环烯烃团员物（COP）材质的培养管，因其布景信号较低。

图2. 名义增强拉曼散射（SERS）检测仪及检测过程默示图。 在带螺旋盖的模范培养管中加入样品、培养基和名义增强拉曼散射检测试剂（标准1）。 将培养管放入名义增强拉曼散射检测仪，仪器在可控温度下孵育样品，按预设标准使样品形成磁富集千里淀，并使用拉曼检测探头对千里淀进行扫描检测（标准2）。 一朝检测到菌体助长，仪器立即向使用者反馈样品为阳性；若在检测过程收尾时仍未检测到助长，则陈诉样品为阴性（标准3）。

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三、拆伙

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3.1. 宗旨考据：大肠杆菌 O157:H7 东说念主工浑浊的食物与海绵样品

图 3. 展示了名义增强拉曼散射检测范例在多种食物基质和不同接种量下的性能。将高载量大肠杆菌 O157:H7 接种到含有 10% 均质牛肉、均质鸡肉、橙汁、好意思味可乐、菠菜或海绵的培养基中。名义增强拉曼散射信号当先处于基线水平，因为大肠杆菌载量低于分析检测限（约 10∧(5)CFU/mL）。跟着时辰推移，细菌增殖使大肠杆菌含量升高，夹心结构形成增加，名义增强拉曼散射信号随时辰增强，反应样品中病原体浓度握住飞腾。本实验中每 30 分钟进行一次名义增强拉曼散射读数。弧线偏离基线的时辰取决于样品中病原体的运行浓度与受损进度。举例，鸡肉样品中大肠杆菌 O157:H7 接种量较高（10∧(6) CFU/g），增菌后 2 小时内即可检出；而菠菜漂洗液样品接种量较低（漂洗液中 38 CFU/mL），约 5 小时才检出。

图3. 接种到不同基质中的大肠杆菌O157:H7。 样品用含有检测试剂的模范大肠杆菌O157培养基按1:10（质地/体积）稀释，然后径直放入仪器进行病原体助长监测。玄色弧线为接种样品，灰色弧线为阴性对照。 接种量分别为：700 CFU/海绵、10³ CFU/g 牛肉糜、10⁶ CFU/g 鸡肉、100 CFU/mL 橙汁、100 CFU/mL 好意思味可乐、38 CFU/mL 菠菜漂洗液。 实验接受420号SERS标签。 所用培养基分别为：缓冲卵白胨水（海绵）、矫正胰卵白酶大豆肉汤+更生霉素（牛肉和鸡肉）、通用前增菌肉汤（橙汁和好意思味可乐）、2倍缓冲卵白胨水（经巴特利磷酸盐缓冲液处理的菠菜漂洗液）。

3.2. 李斯特菌东说念主工浑浊的不锈钢名义

表 1. 展示了名义增强拉曼散射检测范例在环境样品中的检测服从。10 个平行不锈钢试片分别接种 376 CFU 单核细胞增生李斯特菌，同期存在 50 倍浓度的杂菌，并干燥过夜。10 个平行样品均顺利复苏受损的单核细胞增生李斯特菌，而两个仅接种杂菌的对照试片未检出李斯特菌助长。该实验所用培养基频繁需要 40 小时前增菌后才能进行病原体检测，而通过培养过程中的及时监测，李斯特菌阳性样品在 20.4 至 25.5 小时之间即可判定为阳性，平均阳性检出时辰为 23.3 小时。

表1. 不锈钢名义干燥李斯特菌的回收率

3.3. 生牛肉糜与禽肉中的梵衲氏菌

接受名义增强拉曼散射检测范例对生牛肉糜和禽肉中的梵衲氏菌进行检测。牛肉样品东说念主工接种鼠伤寒梵衲氏菌或肯塔基梵衲氏菌，禽肉样品未东说念主工接种，仅检测自然浑浊情况。本实验旨在考据该时代对每份样品 1 个活菌浑浊水平的检测武艺。鼠伤寒梵衲氏菌接种量约为 1 CFU/25 g，即每份样品约 1 CFU，肯塔基梵衲氏菌接种量低于 1 CFU/25 g，具体由最大可能数法详情。自然浑浊的鸡肉糜和火鸡肉糜中最大可能数鸿沟为 0 至 115 CFU/25 g。当接种量接近 1 CFU/25 g 时，受统计学漫衍影响，部分样品会呈阳性，部分呈阴性，取决于待测样品部分中是否实质含有菌体。表 2. 纪念了实验拆伙。第三列为食物中梵衲氏菌的表面含量，由第三方实验室对同批次另一部分样品进行最大可能数分析详情。因此，由于 1 CFU/25 g 接种水平存在统计学互异，最大可能数分析与其他检测范例之间可能存在一定偏差。表格临了三列分别为名义增强拉曼散射法、侧向层析法和平板培养法的梵衲氏菌检测拆伙。由于平板法和侧向层析法使用吞并份牛肉或鸡肉样品，三者拆伙表面上应一致，实质拆伙也确乎相符。悉数样品中，名义增强拉曼散射检测拆伙均与侧向层析法和琼脂平板法一致，确认注解该范例可在培养过程中径直检测病原体，检测限达到每份样品 1 CFU。

表2. 食物样品中梵衲氏菌的分步回收率

东说念主工浑浊生牛肉糜和自然浑浊生禽肉样品的代表性助长弧线数据如图 4. 所示。在这些梵衲氏菌实验中，实验体系模拟了合乎 AOAC 认证的培养基和抗体试剂过程，该过程先在一种培养基中进行 16–22 小时低级增菌，再在另一种培养基中进行 6–8 小时次级增菌。将名义增强拉曼散射检测试剂加入次级增菌培养管中，在次级增菌着手后着实可立即检出梵衲氏菌，早于 22–30 小时侧向层析法过程收尾时的阳性信号。关于图 3. 所用的单一培养基体系，名义增强拉曼散射检测试剂可径直加入低级增菌培养液，从培养着手即可进行及时监测。

图4. a）以约1 CFU/25 g的量东说念主工接种鼠伤寒梵衲氏菌的生牛肉糜。图中炫耀了接种牛肉糜的二次增菌助长弧线（深色弧线）和阴性对照（灰色弧线）。 b）市售自然浑浊的鸡肉糜（n=6）和火鸡肉糜（n=3），最大可能数鸿沟为0.3～115 CFU/25 g。在这种低菌量漫衍下，9份样品中有3份通过名义增强拉曼散射、平板法和侧向层析法均检出阳性（深色弧线）。其余样品在悉数范例中均为阴性，标明禽肉待测部分不含活菌。本实验使用403号SERS标签。

3.4. 阳性检出时辰与病原体载量干系研究

为考据该时代在增菌达到检测限时即可立即检出浑浊样品的武艺，将鼠伤寒梵衲氏菌梯度稀释后接种到三种不不异品基质中：花生酱、巧克力奶以及不锈钢名义。实验接受单一增菌培养基，名义增强拉曼散射检测试剂径直加入培养管内。图 5. 展示了阳性检出时辰与细菌载量的关联性。与预期一致，接种量越高，病原体检出速率越快。与巧克力奶和花生酱比拟，不锈钢试片上的样品检出时辰更长，推测原因是干燥处理使病原体处于高度受损情景。图 5. 中的水平虚线为行业主流商用仪器公开的检出时辰。

图5. 鼠伤寒梵衲氏菌在巧克力奶、不锈钢（拭子）和花生酱中的**阳性检出时辰–接种量弧线。 检出时辰随接种量升高而镌汰。在法定检测限1 CFU/25 g（竖线）下的检出时辰瞻望会比图中所示更长，但仍与面前起初进的免疫检测法（生物梅里埃Vidas®，玄色虚线）和PCR检测法（杜邦BAX®，灰色虚线）很是。

3.5. 李斯特菌属的机灵度与特异性研究

名义增强拉曼散射范例的机灵度和特异性高度依赖抗体与培养基的合作服从，二者需在防止非致病性布景菌群的同期特异性检测病原体。为考据接受优质试剂时该范例的机灵度与特异性，本研究使用来自 Romer Labs® 公司 RapidChek® 李斯特菌属侧向流检测试剂盒中通过 AOAC 认证的抗体与培养基。将不同浓度的多株李斯特菌菌株接种到食物样品中，并与增菌后样品在显色培养基上的平板计数拆伙进行比较。名义增强拉曼散射实验的增菌样品在完好意思 40 小时增菌后，不异使用 Romer Labs® 公司 RapidChek® 李斯特菌属侧向流检测试剂盒进行考据。拆伙汇总于表 3.。实验共测试 5 种食物基质中 4 株李斯特菌的多个接种水平，以为 144 条弧线，其中阴性 48 条，阳性 96 条。总体而言，与平板计数拆伙比拟，名义增强拉曼散射检测的机灵度为 95.3%，特异性为 97.9%。

表3. SERS检测范例在东说念主工接种李斯特菌的食物中的检测性能

四、筹商

4.1. 细菌培养的及时监测

在增菌过程中对细菌培养物进行贯穿监测是临床检测中的旧例技能，举例血流感染检测。这类范例对底本无菌的液体（血液）进行贯穿监测，通过细菌呼吸代谢产物判断是否存在微生物，阳性拆伙代表存在非特异性细菌，这在临床中具有遑急真谛。由于对血培养进行及时监测，一朝检出阳性即可立即陈诉，从而达成快速临床骚扰。在食物安全应用中，运行样品频繁并非无菌。25 克样品中的布景菌群数目可卓越 10∧(6) CFU/g，如表 2. 所示。因此，非特异性细菌传感器在判断样品是否被梵衲氏菌、大肠杆菌等东说念主类致病菌浑浊时参考价值有限。与之相对，免疫分析通过抗体介导达成高特异性病原体检测，但频繁需要较长孵育时辰与屡次洗涤标准以去除干扰物资。即使是研究东说念主员所报说念的范例，自然接受了磁分离与光学检测，但仍需要屡次洗涤标准，因此无法与捏续的细菌培养过程兼容。本文报说念的基于名义增强拉曼散射的免疫分析可将特异性病原体检测与轻浮径直整合到增菌培养过程中，达成病原体检测与培养的一体化。这种新式整合式检测可镌汰检出时辰，达成增菌样品的生物安全紧闭，同期简化举座病原体检测过程。

4.2. 更快的阳性检出时辰

检测时长是指详情食物样品中无病原体（阴性检出时辰）或有病原体（阳性检出时辰）所需的时辰。病原体检测的阴性检出时辰频繁由四个重要因素决定：会诊范例自己的机灵度、检测主义的品貌、主义菌自身的倍增速率，以及培养基在高布景菌群下优先复苏和增殖病原体的武艺。关于培养增菌收尾后才进行的很是法食物病原体检测，阳性检出时辰与阴性检出时辰莫得区别，因为阳性拆伙和阴性拆伙齐在检测过程收尾时同期陈诉。这一宗旨由图 5. 中的水平虚线表露，其中 PCR 检测频繁快于免疫检测。接受名义增强拉曼散射免疫分析进行及时监测时，阴性拆伙在检测过程收尾时陈诉，而阳性拆伙在检测瓶内病原体浓度达到范例的分析检测限时即可立即陈诉。如图 5. 所示，运行载量越高，检出时辰越短。此外，活性高、增殖快的病原体样品会比需要万古辰复苏的受损病原体样品更早被检出。与其他时代一样，名义增强拉曼散射免疫分析的阴性检出时辰由复苏运行样品中一个严重受损病原体所需的时辰决定。图 5. 中 1 CFU/25 克处的竖线展示了这极少。自然图 5. 未炫耀该低接种量下名义增强拉曼散射免疫分析的性能，但表 2. 和表 3. 展示了该时代在 1 CFU 主义接种量下检测阳性的机灵度，并与 AOAC 认证范例（如平板法）进行了对比。值得顾惜的是，这种在主义检测基质的低接种量鸿沟内将名义增强拉曼散射免疫分析与 AOAC 认证范例进行对标比较，是 AOAC 对新式病原体检测进行认证的模范方法。这些数据标明，名义增强拉曼散射免疫分析展现出与 AOAC 认证范例很是的机灵度。

在不锈钢名义存在 50 倍杂菌的要求下检测干燥、受损李斯特菌的拆伙，直不雅体现了更快阳性检出时辰的上风。使用与商用 40 小时李斯特菌范例交流的培养基和抗体，在该浑浊水平下，名义增强拉曼散射范例可在约 23 小时检出不锈钢名义的干燥李斯特菌。提前 17 小时的预警时辰，对食物坐褥企业关停受浑浊坐褥线具有遑急真谛。

4.3. 生物安全紧闭

面前模范的病原体检测需要先对食物样品进行增菌，再取出部分增菌液用于平板、PCR 或免疫分析等检测。掀开含有高浓度增菌病原体的样品存在浑浊检测实验室的风险，顶点情况下还可能浑浊坐褥线。对坐褥设施浑浊的担忧，是食物坐褥企业选拔将病原体检测外包的原因之一。通过将病原体检测整合到密封培养容器中，无需掀开样品，紧闭容器可在保捏透彻生物安全紧闭的情景下径直贬责。这一世物安全紧闭特点，使得食物或环境病原体检测可在更蚁集坐褥现场的位置开展，从而幸免因将样品送往具有二级生物安全水平的外部机构而产生的蔓延与本钱。即使在具备病原体培养要求的实验室中，编造样品间交叉浑浊的风险亦然一项遑急上风。

4.4. 检测过程

将病原体检测整合到培养容器中，过程自己愈加方便，因为培养收尾后无需独特东说念主工操作即可完成病原体检测。关于环境样品和袖珍食物样品，名义增强拉曼散射检测试剂可事前置于培养瓶或袋中，使用者只需在检测着手前加入培养基和食物样品即可。但是，该范例靠近的挑战之一是食物行业部分限制所需的样品体积较大。举例，大肠杆菌 O157 检测常使用 375 克样品，需要卓越 1 L的增菌培养基。咱们已在最高 250 mL的样品体积上完成名义增强拉曼散射检测，服从细致，因此该范例在更大体积下也可能领路踏实。但需要商量试剂本钱等问题。总体而言，名义增强拉曼散射试剂需求量不会随体积呈线性增长，在较大样品体积下可编造试剂浓度，只消存在填塞颗粒形成大于检测激光光斑的磁千里淀即可。举例，咱们不雅察到 250 mL样品仅需 5 mL样品试剂浓度的 20%，即可形成可踏实检测的磁千里淀。尽管如斯，在成就适用于食物行业部分限制大体积样品的检测体系时，试剂本钱和仪器体积依然遑急考量因素。

4.5. 局限性

与任何检测范例一样，名义增强拉曼散射免疫分析也存在一定局限性。看成一种免疫分析范例，其性能在很猛进度上取决于是否具备针对主义物的高亲和力、高特异性抗体。此外，由于抗体在悉数这个词增菌过程中齐存在于培养液中，还要求抗体在食物与培养基搀和体系中、在最高 42 或 45℃要求下保捏踏实。在本研究的测试中，所用抗体在上述时辰和温度要求下均保捏功能活性，而况在 10% 好意思味可乐、橙汁等较低 pH 值样品中也能时常责任。但不错瞻望，部分抗体在这些要求下会发生降解。另外，名义增强拉曼散射信号的踏实性依赖于将磁性颗粒富集到激光映照区域的武艺。关于某些含有大颗粒杂质的食物基质，在仪器想象和磁富集系统想象时必须格外顾惜，确保这些杂质不会干扰磁性颗粒的踏实富集。即使抗体踏实、磁富集重现性细致，大体积样品仍存在实质应用问题。关于体积相配大的食物样品，试剂本钱可能会戒指将检测试剂径直加入沿途培养体积的决策。临了，食物安全行业大齐但愿镌汰病原体检测的用时。但检测用时并非只取决于分析范例的机灵度。培养基对单个受损菌体的复苏武艺，关于决定细菌增殖至可被本范例或其他检测范例检出的水平所需时辰，起着至关遑急的作用。

4.6. 小结

翻新食物检测范例的潜在真谛十分首要。本文所先容的名义增强拉曼散射免疫分析，初度将免疫分析与细菌培养一体化，在不干扰细菌助长的前提下达成病原体的特异性检测。将病原体检测试剂整合到增菌培养液中，可达成病原体水平的及时监测，样品一朝达到检测限即可立即符号为阳性，同期达成样品的透彻生物安全紧闭。本文数据确认注解，该范例在多种食物和环境样品中均具备高机灵度与高特异性的应用后劲。

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发布于：湖南省

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